GLP-1胜肽合成、純化方案與技術探討

類升糖素胜肽-1，（Glucagon-like peptide-1, GLP-1胜肽）及相關衍生物，已成為台灣胜肽藥物開發的重要方向。根據 2026 年初以 Google Scholar 關鍵字「GLP-1」進行檢索之結果，相關研究與專利發表數量近年呈現快速成長趨勢，2025 年檢索結果相較於前年增加超過 40%，相關的胜肽合成與純化需求也隨之顯著上升。通常 GLP-1 是由 30 個以上的胺基酸序列組成，結構上又同時具備親水與疏水的兩親性（Amphipathic）特性。使這類長鏈胜肽在實驗室製備與放大生產過程中，無論在固相胜肽合成 (Solid-phase peptide synthesis, SPPS) 的效率、合成後的溶劑移除、最終純化的效果 以及 實驗溶劑的消耗，都成為研究人員在實驗設計上必須特別思考的課題。

作為台灣的 Biotage® 專業合作夥伴，智聚生科技統整多篇原廠發布的技術白皮書與應用報告，從客觀的角度，探討從微波輔助合成到快速管柱純化過程中，各項化學與物理參數，對 GLP-1 製程結果的影響。協助研究人員理解 GLP-1 胜肽於合成、後處理及純化過程中的關鍵技術考量，實際操作條件仍應依樣品特性進行評估。

1. 微波胜肽合成 (Microwave Peptide Synthesis) 的參數探討

如能於合成階段取得高純度的粗產物（Crude peptide），是後續純化工作得以順利進行的基礎。在 SPPS 過程中，隨著胜肽鏈長度的增加，立體障礙（Steric Hindrance）與分子內氫鍵的形成；常會導致 Coupling 不完全，對產量（Yield）以及 純度（Purity）產生負面的影響。Biotage® 的研究針對微波輔助合成中的 試劑濃度 以及 副反應的控制 進行了詳細的探討。

胺基酸試劑濃度對全長胜肽合成純度的影響 ¹

在一般自動化胜肽合成儀的設計上，研究人員常須採用 0.2M 的胺基酸溶液作為合成試劑。然而，根據 Biotage® 針對長鏈胜肽（如全長 GLP-1胜肽）合成的技術探討，高濃度的試劑在反應速度 和 反應趨勢上有著正面的影響，也進一步對最終產物的純度有著明顯的優勢。

實驗室在使用 Biotage® Initiator+ Alstra™ 系統進行對比實驗時發現，當合成 GLP-1 這類超過 30 個胺基酸的序列時，若在胺基酸當量不變的前提下，將溶液濃度從 0.2M 提升至 0.5M（最終實際反應濃度僅提升約 1.5 倍），即能明顯改善合成效率。這結果也符合化學反應的認知，較高的反應物濃度可提供更強的驅動力，進而促使胺基酸偶聯（Coupling）盡可能完全反應。從下方的層析圖譜上可以比較出，右側使用 0.5M 濃度合成的粗產物，所產生的副產物數量與訊號強度均明顯下降，使得 GLP-1 的純度能明顯提高。此結果顯示，在微波加熱的輔助下，適度提高試劑濃度是提高長鏈胜肽合成純度的一項有效策略。

天門冬醯亞胺重排 (Aspartimide Rearrangement) 的觀察與控制 ^{2 3}

Biotage® 的技術文獻指出 GLP-1胜肽 及其受體促效劑的序列中，可能具備發生此結構重排的潛力。此外，一般在微波合成過程中，為了增加偶聯反應的效率，常會將 Fmoc 去保護基（Deprotection）階段的反應溫度設定於 75°C，也會進一步促使副反應的發生。因此研究人員需特別留意實驗設計和合成系統的條件設定，以維持胜肽合成的純度和正確性：

• 文獻建議於 Piperidine 溶液中添加少量的酸性物質（ 0.1 M HOBt）來降低溶液的鹼性。
• 或 選用鹼性較弱的 Piperazine（經驗上建議濃度為 5%）進行反應。
• 還可以在手動或自動合成系統中，針對高風險的胺基酸位置，限定以 50 ℃ 較低的反應溫度，甚至是常溫方式進行偶聯反應。
• 也可進一步在選擇胺基酸時，選用側鏈帶有較大立體阻礙的保護基（如 Dmb 或 TOM），以物理性空間障礙來抑制副反應的發生。

👉 延伸了解：[ Initiator+ Alstra™ 全自動微波胜肽合成系統 ]

2. 胜肽合成後處理 (Post-Synthesis Workup) 之物理化學機制探討 ⁴

固相合成完成後的胜肽產物，仍須使用高濃度三氟乙酸（Trifluoroacetic acid, TFA）進行裂解（Cleavage），才能將胜肽從樹脂上切割下來，並同時移除剩餘的胺基酸側鏈保護基。然而，裂解液（Cleavage cocktail）中所包含的 TFA、螯合劑（Scavenger）與 試劑，也會在過濾之後，與目標胜肽同時被收集下來。那麼如何將胜肽從這混合溶液中高效且安全地分離出來，便成為實驗室胜肽製備過程中的重要挑戰。

傳統乙醚沉澱法 (Ether Precipitation) 的應用與侷限

最常見的分離方法，是將裂解後的混合液滴入事先冰凍處理的乙醚或其他醚類溶液中，利用胜肽不易溶於非極性醚類溶劑的特性，將胜肽沉澱下來；而裂解液中的 TFA、Scavenger、以及其它有機雜質則可溶於其中。最後再經過離心、去除上清液、溶劑揮發、回溶、冷凍乾燥（Lyophilization）等步驟，即能以較低的成本快速取得固態的粗產物。

但醚類沉澱法會面臨幾項特性上的限制，當面對短鏈胜肽或具有高度疏水性的序列時，目標胜肽在醚類中仍具有一定的溶解度，就會導致胜肽無法完全沉澱，造成純化前的產量大量損失。但即使是面對如 GLP-1 這類序列較長、含有親水性片段的胜肽時，醚類沉澱法仍然也有以下幾個缺點：

• 從冷凍溶劑的製作到胜肽冷凍乾燥等步驟，會消耗大量的等待時間。
• 使用極度易燃且具揮發性的醚類溶劑，對實驗室財產與人員的安全產生隱患。
• 隨著環保議題的升溫，廢液的保存和處理，也會產生額外的經濟負擔。

高效真空蒸發技術：Biotage® V-10 Touch 的物理機制

而 Biotage® 提出了另一種更高效的工作流程：利用 V-10 Touch 高效真空濃縮系統，直接移除高沸點溶劑與裂解液。雖然，習慣上我們會儘量避免胜肽被直接加熱，減少變性（Denaturation）或引發不可逆的化學降解（Degradation）的風險，特別是 GLP-1 等序列較長的胜肽。但 V-10 Touch 結合「高真空環境」與「快速旋轉」兩大物理機制，並透過精確控制物理參數來解決此問題：

• 高真空環境降低沸點：
  透過真空泵浦（Vacuum pump）的協作，可大幅降低系統內的壓力，使得如 DMF、DMSO 或 TFA 等原本高沸點的溶劑，能在接近室溫（通常低於 30-40°C）的條件下達到沸點並氣化；盡可能在濃縮的同時，也保護了 GLP-1胜肽的結構完整性。
• 快速旋轉增加蒸發面積與防止突沸（Bumping）：
  樣品可直接放在閃爍計數瓶中，在真空狀態下進行極高速的旋轉，利用離心力將液體薄薄地貼附在瓶壁上。這不僅極大地增加了蒸發表面積（加速氣化），更重要的是，離心力能有效地抑制真空濃縮中最常見的「突沸」現象，避免珍貴的胜肽樣品交叉污染或損失。

透過這種溫和的物理分離方式，研究人員能迅速地繞過醚類沉澱，並於合成完成當天，馬上獲得乾燥的胜肽粉末，以進入下一步的層析純化。

👉 延伸了解：[ Biotage® V-10 Touch 超高速濃縮儀 ]

3. GLP-1 的快速管柱純化 (Flash Chromatography) 策略

胜肽純化往往是整個胜肽製備中最耗時且成本最高的一環。長期以來，擁有極佳解析度的製備級高效液相層析（Prep-HPLC）技術 ，無論在台灣乃至於全世界範圍，都是胜肽純化的首選；但面對 GLP-1 這種極具市場潛力的胜肽來說，其於放大製程（Scale-up）時仍會產生以下幾個瓶頸：

• 樣品單次的進樣量（Loading capacity）較少，需要分次少量的純化。
• 每針樣品的純化需要較長運行時間，額外還有平衡和清洗的步驟。
• 需要消耗大量高純度有機溶劑，以及隱藏的廢液處理成本。
• 系統建置、每年維護、管柱耗材的成本較高。

隨著中壓快速管柱純化 (Flash Chromatography) 系統在設計上的升級，以及管柱填料中球形矽膠固定相（Stationary Phase）的技術發展；使快速管柱純化技術在胜肽純化效能上有顯著的提升，不僅可作為 Prep-HPLC 的前置純化處理工具，甚至可在合適的方法開發下，直接作為胜肽純化的主要手段。Biotage® 針對 GLP-1胜肽 發布了多篇技術文件，詳細探討了純化參數的選擇和設定。

👉 延伸了解：[Biotage® Selekt 自動管柱純化系統介紹]

固定相（Stationary Phase）的選擇：C18 V.S. C4 ⁵

在胜肽研究領域中，一般會採用 C18 或 C4 的固定相管柱，進行逆相層析（Reversed-Phase Chromatography）純化。而固定相碳鏈的長度決定了其與胜肽分子的疏水性交互作用力。針對 GLP-1 這種長度超過 30 個胺基酸的大分子胜肽，選擇合適的管柱填料至關重要。

C18 管柱

作為胜肽純化的首選，C18 提供了最強的疏水滯留能力與極高的表面積。Biotage®原廠測試結果顯示，使用高品質球形矽膠的 Biotage® SNAP Bio C18 或 Sfär C18 管柱，能對 GLP-1 及其結構極為相似的副產物（如不完整的胜肽）或 其他 Cleavage 後殘留的雜質（如保護基和螯合劑）提供優異的分離和純化效果。

C4 管柱

由於碳鏈較短，疏水作用力較弱，胜肽在 C4 管柱上通常能以較低濃度的有機溶劑沖提（Elution）下來，也有助於提高極端疏水胜肽的回收率。對於超大分子（>40 個胺基酸）、極度疏水或易與 C18 發生不可逆吸附的胜肽來說，C4 管柱為研究人員提供了另一種選擇。

而根據實際測試的結果，針對具有兩親性特徵的 GLP-1胜肽，雖然在C18或C4的快速純化管柱的純化表現上並無太大差異，但C18的快速純化管柱仍能提供較好的滯留能力與純化效果。

管柱純化的pH難題：選擇性 (Selectivity) 與質譜游離的衝突

在處理合成純度較低的胜肽粗產物時，研究人員在純化策略的制定上，經常會面臨一個極為棘手的矛盾情境。

追求分離度：改變移動相酸鹼值以取得最佳選擇性

從早先實驗結果已知，含有 0.1% TFA 的酸性移動相（Mobile phase）能在 GLP-1胜肽 的純度及回收率上取得良好的平衡 ⁶。但當 GLP-1 初始純度僅有 27% 時，其訊號峰仍與大量的副產物和雜質訊號重疊，導致第一次純化得到的 GLP-1 純度僅提升至 64%，仍需進行第二次的純化以達到下一階段的要求。⁷

由於 GLP-1 的等電點 (pI) 約莫為 5.35，因此研究人員嘗試將 0.1% 氨水（NH₄OH）加入移動相中，將環境大幅調整為鹼性（ pH 值接近 10）；此時，胜肽分子本身的質子化狀態會發生根本性的改變，這種改變能在 C18 管柱上創造出更好的選擇性，使得原本難以分離的雜質被徹底排除，進而在單次運行中將純度從 27% 大幅提升至 85% 。⁸

質譜的限制：鹼性環境導致游離失效 ⁹

當快速管柱系統使用質譜來蒐集胜肽時，通常會選用 ESI（Electrospray Ionization）的游離技術，再依照目標物的特性以及狀態來決定偵測模式。一般情況下， 等電點為 5.35 的 GLP-1胜肽會以酸性移動相進行純化，並以正電模式進行偵測。但由於純化系統的流速及濃度過高，需要先經過自動分流器，藉由載體溶劑（Carrier solvent）稀釋並送至質譜儀中。 從下圖的實驗結果可以得知，酸性載體溶劑能提供正確且低雜訊的訊號。

然而當研究人員希望以鹼性環境（pH 約為10）取得更好純化效果時，儘管理論上 GLP-1 會帶有負電，而使用負電模式進行偵測。但在實際檢測卻顯示，無論載體溶劑的酸鹼度為何，不僅沒有辦法偵測到正確的負電訊號外，正電模式下也偵測不到目標胜肽。

目前推測可能的原因是鹼性環境下， GLP-1 因質子化而產生構型改變，即使經過載體溶劑的緩衝與稀釋，仍無法讓胜肽分子於電灑游離的過程中有效地帶上電荷，導致質譜儀的偵測訊號徹底消失。

突破化學盲點：Biotage® 的兩階段純化策略 (Two-Step Purification) ¹⁰

為了解決上述「高分離度」與「偵測靈敏度」無法在同一時空並存的物理化學限制，研究人員針對 GLP-1胜肽 提出了一套高效的「兩階段純化策略」，這套方法結合快速管柱純化的大量進樣、高效的優勢，以及質譜導向收集的精準度：

1. 先捨棄對質譜的依賴，專注於進樣量的提升以及去除主要雜質
   • 先選用較大的管柱，以帶有 0.1%氨水 的鹼性移動相來進行初步純化。
   • 並以紫外光 (UV) 訊號來進行收集確保樣品的回收率。
   • 去除副產物、保護基殘基、以及Cleavage cocktail殘留的試劑，將純度由 27% 提升至 87%。
     
2. 再以質譜訊號，精準純化 GLP-1 目標胜肽
   • 將第一階段的高純度收集物，利用如 V-10 Touch 這類高效濃縮設備，快速乾燥並回溶於小體積的酸性純水中。
   • 再以較小的管柱，和帶有 0.1% 三氟乙酸 (TFA) 的酸性移動相條件，並搭配酸性載體溶劑進行第二輪純化。
   • 即得到更加精準的目標胜肽訊號，最終使 GLP-1 的純度成功突破 90%。

在這套兩階段純化的工作流程中，每次的管柱純化需耗時約 20 分鐘，以相當高的效率突破製備型 HPLC 純化的瓶頸，且回收率也可達到85%。無論在純度以及樣品回收率，均能達商業製程上的標準。

👉 延伸了解：[Biotage® Sfär Bio C18 胜肽純化管柱系列]

結論：建構全方位的高效多胜肽工作流程

GLP-1胜肽及其衍生物的開發，從微波合成中胺基酸濃度的精確控制，到利用真空物理機制溫和移除裂解液，再到充分利用胜肽等電點特性進行快速管柱純化，每一個參數的最佳化，都直接關係到最終的產率與純度。

Biotage® 透過提供 Initiator+ Alstra™（精準合成）、V-10 Touch（安全快速置換溶劑）以及 Selekt 系統搭配 Sfär 管柱，為研究人員勾勒出了一條連貫且高度自動化的工作流程。而智聚生科技不僅提供相關設備的銷售，也將這套自動化流程引入台灣的學術以及商業實驗室。歡迎隨時與我們聯絡，進一步客製化您的胜肽自動化解決方案：

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作者：智聚生科技技術團隊

智聚生科技為 Biotage® 台灣合作夥伴，本文引用之技術資料主要來自 Biotage® 原廠公開技術文獻與應用報告，內容以技術解析與研究資訊整理為目的。

團隊長期協助台灣學術研發部門和生技製藥生產單位，建立胜肽合成、樣品前處理與純化的自動化流程，並提供 Biotage® 相關產品技術支援。

參考文獻

1. Denton, E. (2023). Does amino acid concentration really matter during peptide synthesis? Biotage®. ↩︎
2. Denton, E. (2023). Has my peptide undergone an aspartimide rearrangement? Biotage®.
   ↩︎
3. Denton, E. (2023). Preventing aspartimide rearrangements during fmoc-based solid phase peptide synthesis Biotage®. ↩︎
4. Denton, E. (2023). Post synthesis workup: What steps are necessary and what aren’t? Biotage®. ↩︎
5. Denton, E. (2023). Which Stationary Phase Should I Chose For My Peptide Purification? Biotage®.  ↩︎
6. Denton, E. (2023).  How does mobile phase modifier concentration impact peptide purity with flash chromatography? Biotage®. ↩︎
7. Denton, E., & Bickler, J. R. (2017). Improving peptide purification via flash column chromatography by modulating mobile phase pH. Biotage®. ↩︎
8. Biotage. (2019). Achieve highly pure peptides with high performance flash chromatography. Biotage®. ↩︎
9. Denton, E. (2023).  How does my mass spectrometer carrier solvent impact mass-directed purification of peptides? Biotage®.  ↩︎
10. Denton, E., & Bickler, J. R. (2017). Improving Peptide Purification via Flash Column Chromatography by Modulating Mobile Phase pH Biotage®.  ↩︎