翻譯自 How To Select a Pore Size for C18 Reversed Phase Chromatograph — 2023, Caleb Ferguson, Biotage
無論在蛋白質質體學、食品藥物化學還是分子生物學領域，大分子純化是決定分析品質的關鍵步驟，而逆相層析（Reversed-phase Chromatography）則是最常使用，且效果穩定的方法之一。它的核心原理是利用填料（Resin）表面的疏水性官能基（例如 C18 烷基鏈）與樣品中疏水區域的相互作用，使目標物被滯留在固定相（Stationary Phase）；再藉由移動相（Mobile phase）的極性變化來控制樣品的洗脫順序。
在藥物開發過程中，當樣品需上質譜（Mass Spectrometry, MS）或 MALDI （Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization）進行分析之前，逆相層析經常被作為關鍵的去鹽（desalting）步驟，以去除干擾離子、提高檢測靈敏度與樣品穩定性。
什麼是孔徑？為什麼它重要？
雖然逆相層析的概念看似簡單，但要讓其發揮最大純化效能，仍需要考慮許多變數，包括填料的種類（C18、C8、C4… 等）、粒徑（Pore size）、表面化學修飾、孔徑（Pore Size）等等。
其中孔徑是指構成填料的矽膠（Silica）顆粒內部的微小孔洞，通常大小以 Å（1 Å = 10⁻¹⁰ 公尺）為單位。其大小對樣品的結合行為影響特別大，因為它將直接決定樣品分子是否能進入填料內部，與內部的表面官能基交互作用。
事實上填料顆粒並不是實心，而是像海綿一樣充滿微孔。這些孔洞提供了巨大的內部表面積，讓更多樣品分子有機會與填料表面接觸。實際上，高達 99% 的填料表面積來自這些孔洞內部，外部的表面積幾乎可以忽略不計。因此，若樣品無法進入填料的孔洞，就等於失去了幾乎所有的結合空間，將直接影響層析的回收率。
孔徑與分子大小的作用機制
要理解填料的孔徑（通常範圍為 80 Å ~ 300 Å）與樣品大小（如分子量、結構體積）之間的關係，可以用樣品擴散（Diffusion）的方式來理解，有以下三種情況：
- 分子小於孔徑
小分子進入寬敞的入口毫不費力，能迅速擴散進孔洞，並與填料內部的表面充分接觸，可以得到高結合效率與高回收率的結果。 - 分子接近孔徑大小
當分子尺寸與孔徑相近，就像帶著大型行李通過狹窄的門口，雖然能進去，但速度慢且容易卡住，擴散效率降低，結合速度變慢，導致整體純化效果和回收率下降。 - 分子大於孔徑
如果孔徑比分子直徑還小，那麼分子根本進不去孔洞，結果就是完全沒有任何的滯留作用，樣品會直接被移動相沖走，回收率接近零。
因此，樣品是否能夠順利擴散進入孔洞，是整個結合反應的速率限制步驟（rate-limiting step），也是決定結合效率與層析效果的關鍵因素。
以下以相同的胜肽（Peptides）樣品經由不同孔徑 C18 填料處理後的實驗結果顯示，即使是同樣的作用原理，不同孔徑也會導致大分子純化的回收率產生差異。
| Resin Pore Size 填料孔徑 | 90 Å | 300 Å |
|---|---|---|
| 起始物 Starting (μg) | 233 | 182 |
| 產量 Yield (μg) | 58.5 | 38.6 |
| % 回收率 Recovery | 25.1% | 21.2% |
在這個例子中雖然看起來回收率相近，但實際應用上，小孔徑對胜肽片段的純化更具選擇性與效率，而大孔徑則能保證對分子較大的蛋白有良好吸附性。然而，在處理大型胜肽或蛋白質（Proteins）時，如果仍使用 90 Å 樹脂，回收率就會顯著下降，因為這些大分子會直接被排除在孔外，無法進入內部進行有效的結合。
小孔徑與大孔徑填料的應用差異
Biotage 提供的 90 Å 與 300 Å 的 C18 逆相填料，能滿足多數蛋白質與胜肽的純化需求：
- 小孔徑填料（~90Å）
能與小分子化合物或小型胜肽分子產生非常良好的結合作用，適合純化短胜肽；並會排斥大型蛋白質與大分子胜肽。因此，小孔徑的樹脂特別適合在蛋白質分解後進行胜肽片段的純化。
例如：在胜肽圖譜分析（Peptide mapping）前的樣品前處理中。它們能有效捕獲分解後的產物，並將未分解的大型蛋白質排除在外，從而提升樣品的純度與質譜分析的精確性。 - 大孔徑填料（~300Å）
相對地，當需要純化完整蛋白質或大型胜肽時，就必須選擇大孔徑樹脂。這類樹脂的孔洞較大，能夠讓高分子量的目標分子，順利進入內部表面並發生結合。雖然大孔徑樹脂的單位表面積會略低於小孔徑樹脂，但對於大型分子的捕獲效率卻會大幅提升。
例如：表達重組蛋白後，樣品中含有大量緩衝鹽與其他小分子副產物。此時選擇 300 Å 填料能讓大型蛋白質有效結合，再用梯度洗脫去除鹽分，達到脫鹽與濃縮的效果。
產品選擇與客製化
Biotage 針對大分子純化提供 Biotage® Sfär Bio C18 的快速純化管柱，其 20 μm 的粒徑搭配 300 Å 的孔徑，可在胜肽合成後進行快速的大量純化；針對質譜分析，Biotage 另設計有兩種標準孔徑（90 Å 與 300 Å）的 C18 PhyTip® 產品。
兩者都可分別搭配 Biotage® Selekt 或者 ME System 自動化樣品純化系統使用，並提供以下優勢：
- 高效純化低至微克級蛋白/胜肽片段
- 避免分析物損失與非特異性吸附
- 可客製化填料
如果研究需要特定孔徑，也可以透過客製化裝填（Custom packing）服務獲得最佳化的解決方案。這種彈性對於開發新型分析方法與特殊樣品處理流程的研究人員來說尤其重要，因為它能避免因孔徑不匹配而導致的結合效率下降或目標分子損失。
結語
逆相層析是一項技術門檻不高，但設計需謹慎的樣品前處理技術。其中，「孔徑大小」往往是被忽視但關鍵的參數。選擇適當的孔徑，不但可以提升樣品回收率、分析準確性與質譜靈敏度，還能大幅簡化樣品流程，節省時間與成本。
在藥物開發、生物標誌物鑑定與蛋白質體學研究日趨精密的今天，深入理解這些基本操作細節，將是成功完成高品質研究的關鍵之一。
有關使用C18 PhyTip管柱進行質譜分析的好處，請查閱應用文件！
若需要不同孔徑的填料，請務必與我們聯繫。
