酸性pH值如何影響逆相層析分離?

層析技術（Chromatography）是一門結合了科學邏輯與實務經驗的藝術，在化學分析與化合物純化中扮演關鍵角色。無論是來自合成實驗的反應產物，還是天然物中次級代謝物（Secondary metabolites）的研究，都可能包含多種需要分離與純化的成分。這些化合物的物理及化學性質由於結構、極性、電荷狀態等特性差異甚大，因此在實際進行層析時，常常會遇到各種不同的困難與挑戰，也並非所有的層析分離都可以在「中性」條件下完成。

而所謂的「中性」移動相（“Neutral” Mobile phase），指的是不額外添加入酸、鹼修飾劑（Modifier）或 緩衝液（Buffer）的溶劑系統。在許多情況下，中性移動相確實能有效完成分離。然而，當樣品中含有可離子化或本身具有酸鹼性質的化合物時，使用中性移動相可能導致峰形變形、分離度效果不佳甚至共洗脫（co-elute）的情形。這時，就需要考慮對移動相進行酸化或鹼化的處理。但在實際應用中，我們可能無法完全了解樣品中所有的目標物或副產物的pKa值（酸解離常數），那麼該如何判斷是否應在移動相中加入酸性或鹼性修飾劑呢？

當然目標化合物是否具有明顯的酸鹼性質是最簡單的判斷方式，例如：酸類、醯胺類、含胺基的鹼性化合物…等等；這些化合物在中性的分離過程中，會處於離子化（Ionization）狀態，就會因為極性變高，而在逆相層析（Reversed-phase chromatography）管柱中縮短滯留時間（Retention），造成峰形前移（Fronting）或峰形拖尾（Tailing）的問題。此時，若能藉由酸化或鹼化適當調整移動相的pH值，抑制這些化合物的電離行為，就能改善峰形、提高保留，並提升整體分離效果。

這篇文章中，我將透過兩個實際案例，說明在層析過程中加入酸性試劑如何改善峰形、提升選擇性與純化效率。

案例一：低pKa化合物的分離

當待純化的化合物擁有較低的pKa值時，使用酸化的移動相是一個有效策略。以反相層析為例，若能將移動相 pH 值調整為目標化合物 pKa 值以下 2 個單位，就能大幅減少其離子化程度，使化合物以電中性形式存在。從而提升其疏水性，增加與疏水固定相（Stationary Phase）的交互作用，達到更穩定的保留與分離效果。

操作方式與設備

實務上，可藉由在移動相（例如水）中加入甲酸（Formic Acid）、醋酸（Acetic Acid）或三氟乙酸（Trifluoroacetic acid, TFA）來達成酸化效果。若使用的層析系統支援三元溶劑（可同時在移動相中使用三種溶劑），以固定比例混合進主移動相中，達到穩定的pH值修飾效果。若系統無法支援三元溶劑的功能時，也可採取預先配製酸化的移動相的方式，但須注意溶劑相容性的問題。

以下是在 Biotage® Selekt 系統上分離純化馬尿酸（Hippuric acid）與靛紅酸酐（Isatoic anhydride）的一個實際案例。在中性純化環境下進行層析時，可以觀察到馬尿酸（ pKa 約為 3.6）的波峰出現明顯前移（Fronting）現象，而靛紅酸酐的峰形也出現峰形不對稱的情況（見圖一）。

這種峰形異常的現象主要是因為目標化合物被部分離子化，溶液中同時存在電中性（分子態）與離子態兩種形式。離子化後的分子極性上升，與逆相固定相的疏水作用降低、滯留效果下降，因此更容易被沖提，造成波峰前移與不對稱峰形。

為了解決這個問題，透過將第三種溶劑設定為 1% 的TFA水溶液，然後在整個梯度過程中固定以10%的比例進行添加，最終使整體變為 0.1% TFA的酸性移動相。這樣的處理成功抑制了的離子化，促使馬尿酸與靛紅酸酐恢復中性型態，結果顯示峰形明顯改善（見圖二）。

峰形變得更尖銳，滯留時間稍微延長，表示化合物疏水性上升，與固定相的疏水作用增強，達到理想分離效果。

案例二：改善分離選擇性

在逆相層析方法開發中，關鍵在於最大化選擇性（Selectivity）的效果，也就是盡量增加彼此相鄰吸收峰之間的滯留時間差距。若選擇性不足，即使是分離峰形良好，兩個化合物也可能重疊或同時被沖提出來。

在某些情況下，只需要換個有機溶劑種類，就可以改變選擇性。例如，將移動相的乙腈（Acetonitrile）改用甲醇（Methanol），或反之從甲醇改為乙腈，不同性質的溶劑特性會影響化合物與固定相間的相互作用。然而有些情況就需要透過修飾劑改變 pH 值，來改變目標化合物或副產物的解離狀態，從而產生提高選擇性。

實驗案例

在第二個案例則是使用 Biotage® Isolera Dalton 2000 系統，純化一個由琥珀酸（Succinic acid）與 α-甲基苯胺（α-Methylbenzyl amine）反應所產生的醯胺反應（Amide reaction）產物。在使用中性pH值條件下進行純化時，可以觀察到產物（+m/z 221.8）與一個副產物（+m/z 342.8），由於兩者的疏水性非常相近，在純化時幾乎被共同沖提（co-elution）出來，難以分離（見圖三）。

為解決此問題，額外添加 0.1% 乙酸作為第三種溶劑 ，並以固定比例的加入移動相系統中。經此酸化後，副產物因為結構中帶有胺基，被質子化成離子態，增加極性，進而減少其滯留時間；而目標產物雖也被質子化，但因整體疏水性仍高於副產物，故滯留時間反而被略為延長，兩者出峰時間差距增加，分離效率大幅提升（見圖四）。

酸化流動相的化學原理解析

從化學角度來看，當移動相中加入酸，就等同於在系統中引入質子。在此情況下，凡是 pKa 高於移動相 pH 的化合物，就會被解離成帶正電的離子態。一般離子化後的化合物會比原始狀態具有更高的極性，對疏水性固定相的親和力（Affinity）減弱，使其在逆相管柱中滯留能力下降。此外，極性分子也對極性溶劑具有更好的溶解度，因此容易被提前洗脫出來。

相反地，若化合物的 pKa 等於或低於流動相 pH，則會被質子化，轉變為中性形態（分子態），疏水性提升，在逆相管柱中的滯留時間也會延長。此一機制就是利用酸、鹼修飾提升層析分離效率的基礎。

這些現象與應用，不僅體現在分析級層析和實驗室管柱純化上，在樣品前處理的萃取步驟，甚至到製備型 Flash 的大量純化，都同樣適用。

結論與應用建議

綜合上述內容，當我們在設計逆相層析的方法時，除了考慮溶劑比例、流速外，也應將溶劑的 pH 調整納入考量。特別是當遇到峰形異常、選擇性不足、甚至是共同洗脫的情況時，建議可以透過下列步驟進行優化：

• 初步判斷化合物是否具有解離特性。
• 查詢或估算化合物的 pKa 值。
• 設計流動相 pH 範圍，盡量使用 pKa ±2 以外的範圍。
• 小規模實驗測試不同的酸化條件，可使用 TFA、乙酸、甲酸等試劑。
• 再根據峰形與滯留時間，來評估效果。

此外，使用具多溶劑控制功能的 Flash 系統，如 Biotage® Selekt 或 Isolera Dalton，可以透過軟體的設定，自動的以固定比例的方式，添加第三種試劑到移動相中，能大幅提升實驗靈活性與方便性。

最後提醒，在使用TFA、醋酸或其他酸性修飾劑時，應根據質譜或後端分析設備的相容性進行選擇。某些酸（如TFA）可能會干擾後續質譜訊號，需特別注意。

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