流速在快速管柱純化中的重要性

在快速管柱純化（Flash Chromatography）領域中，「流速（Flow Rate）」設定是影響分離效能、分析結果可靠性以及操作效率的重要因素之一。也經常遇到客戶提出關於流速對純化結果影響的問題，其中最常見的兩個疑問是：

• 如果降低流速，分離效果會提升？
• 如果提高流速，分離效果是否會提升並且加快分析完成時間？

這兩個問題看似簡單，但其背後涉及層析理論、流體力學、質量傳遞效率（Mass transfer kinetics）以及實際應用情境，因此沒辦法用一個單一的結論來回答這些問題。本文將透過理論分析、實驗數據與實務經驗，對這兩個問題做完整解析，幫助讀者更清楚地了解流速對快速層析的影響。

流速與線速度的關係

在層析理論中，流速 與 線速度（Linear Velocity）兩者是相關聯，但不完全相同的概念。流速（mL/min）指的是每分鐘通過管柱的移動相體積，而線速度（mm/min）則是移動相在管柱內的實際移動速度。

線速度可由以下兩個基本算式而得：

1. \displaystyle\scriptsize\text{柱體積 Column Volume (mL)} \div \text{流速 Flow Rate (mL/min)} = \text{流經一個柱體積所需時間 Minutes (min)}
2. \displaystyle\scriptsize\text{管柱長度 Bed Depth (mm)} \div \text{流經一個柱體積所需時間 Minutes (min)} = \text{線速度 Linear Velocity (mm/min)}

進一步將上面兩個算式整合成以下線速度換算公式，則能看出線速度與流速呈現成正比：

\boxed{\displaystyle\scriptsize\text{線速度 Linear Velocity (mm/min)} = \frac{\text{管柱長度 Bed Depth (mm)}\times\text{流速 Flow Rate (mL/min)}}{\text{柱體積 Column Volume (mL)}}}

再經過移項得到流速換算公式：

\boxed{\displaystyle\scriptsize\text{流速 Flow Rate (mL/min)} = \frac{\text{線速度 Linear Velocity (mm/min)}\times\text{柱體積 Column Volume (mL)}}{\text{管柱長度 Bed Depth (mm)}}}

線速度與管柱純化效率的關係

那線速度又是怎麼影響管柱純化？層析分離效率一般可由理論塔板高度（Height Equivalent to a Theoretical Plate, HETP）來判斷，而根據 凡第姆特方程式（Van Deemter Equation），HETP取決於三個主要因素：

1. 多路徑擴散：由填料顆粒大小與排列造成的流路差異。
2. 縱向擴散：溶質分子沿流動方向的自然擴散效應，流速越低影響越大。
3. 質量傳遞阻力：溶質分子在流動相與固定相之間轉移的速度限制，流速越高影響越大。

Van Deemter 方程式可簡易表示為：

\boxed{\displaystyle\scriptsize\text{理論塔板高度 HETP} = \text{多路徑擴散 (A)} + \frac{\text{縱向擴散 (B)}}{\text{線速度 Linear Velocity}} + \text{質量傳遞阻力 (C)}\cdot\text{線速度 Linear Velocity}}

其中線速度影響了縱向擴散與質量傳遞阻力。當線速度太低，縱向擴散的影響會擴大；但當線速度太高，質量傳遞阻力也會隨之變大。HETP與線速度呈現一個 U 型曲線（雙曲線）的非線性關係。

當線速度過低或過高時，HETP 都會升高，這也就代表層析分離效率下降，只有在中間區間的最佳線速度，HETP 值最低，層析分離效率最佳。

填料粒徑對最佳線速度的影響

Van Deemter 公式中的 A 項常數（多路徑擴散）則被填料的粒徑（Particle Size）和管柱填充得均勻度所影響。若管柱的填充技術高超且穩定 或是 直接購買由專業設備填充的商品化管柱；那麼填料的粒徑就是主要影響最佳線速度的關鍵因素。

如上圖（圖1）所示，對於小粒徑填料（如 3 μm 或 5 μm 的 HPLC 管柱），最佳線速度（或最佳流速）相對較高，且在線速度改變時性能下降較不明顯； 而粒徑 1.9 μm 的填料，其層析的效率則明顯較好，這也就是 UHPLC 會採用小粒徑管柱的原因。

對於通常使用大粒徑填料（15 μm 甚至 50 μm ）的快速層析管柱來說，理論上最佳線速度會相對較低，且如果使用的流速偏離最佳範圍，分離效能的下降也應該會更加顯著。那麼在現實當中的表現會如何？是否真的必須「精準」設定在最佳流速？是否會有一點彈性的空間？

快速管柱純化中的實驗驗證

為了驗證流速對分離效果的影響，我使用了一支12克的 Biotage® Sfär C18管柱，以及一個由兩種成分組成的樣品，採用相同的溶劑系統與梯度條件，在Biotage® Selekt 快速管柱純化系統上進行測試，並以流速作為操作變因；從 20 mL/min 開始，逐步增加至 50 mL/min。以下是結果圖示（圖2）：

從結果來看，雖然在這個簡單的分離案例中，流速（或線速度）的變化對層析的結果影響不大，但還是能觀察到當流速從 20 增加至 30 mL/min 時，其波峰寬度（Peak Width）明顯變窄。尤其是第一個沖提的化合物，這意味著分離純化效果會更好。接著當流速提升至 40 與 50 mL/min 的高流速下，波峰寬度也確實有所增加，表示效率又開始出現下降的趨勢。

當我們量測出 波峰寬度 及 滯留時間（Retention Time），則可透過以下兩個公式計算出理論板數（Number of Theoretical Plates），以及兩個成分的 HETP。

1. \displaystyle\scriptsize\text{理論板數 Number of Theoretical Plates} = 16 \cdot\left(\frac{\text{滯留時間 Retention Time}}{\text{波峰寬度 Peak Width}}\right)^2
2. \displaystyle\scriptsize\text{理論塔板高度 HETP} = \frac{\text{管柱長度 Bed Depth (mm)}}{\text{理論板數 Number of Theoretical Plates}}

並以表格方式呈現出不同流速實驗的HETP計算結果（表1），再以折線圖的方式呈現出其變化（圖3），還是可以明確判斷 30 mL/min 是最佳流速，因為這時的 HETP 值最低；而實際的純化結果，也與理論上的層析效果相符合。

實際應用上的流速建議

在這個案例中，由於兩個成分的滯留時間差異較大，屬於相對容易分離的樣品。即使是使用 50 mL/min 的高流速進行純化，其分離效果也沒有明顯下降，反而有助於縮短純化的時間。但如果目標化合物與雜質的滯留時間相近、相互干擾較大時，可能就得盡量以最佳線流速作為條件，以面對更具挑戰性的純化任務。

特別是在管柱純化方法開發時，要從小量的測試放大到試量產及純化，甚至是量產型純化規模，都必須確保線速度保持一致；若僅按照比例增加流速，在大多數的情況下，峰形或滯留時間都會容易發生變化，無法保持相同的分離效果。

表2為 Biotage® Sfär 管柱的參數，在轉換不同規格的管柱時，可藉由此表迅速得到每支管柱的規格，以方便在線速度與流速之間轉換。

管柱尺寸 Column Size	內徑 ID (cm)	管柱長度 Length (cm)	柱體積 Column Volume (mL)
5 g	1.64	4.30	7
10 g	2.00	5.60	15
25 g	3.02	7.50	42
50 g	3.94	7.80	80
100 g	3.94	15.80	150
200 g	5.92	14.50	310
350 g	5.92	25.00	530
750 g	8.20	29.10	1145
1500 g	10.70	32.80	2260

以 10 g 的 Biotage® Sfär 管柱純化方法為例，若流速為 30 mL/min 時有最佳的純化效果，那麼可以查表得知管柱長度為 5.6 cm（56 mm）、柱體積為 15 mL，套用換算公式可算出其線速度為 112 mm/min。計算方式如下：

\scriptsize\begin{aligned}\displaystyle\text{線速度 Linear Velocity} &= \frac{\text{管柱長度 Bed Depth (mm)}\times\text{流速 Flow Rate (mL/min)}}{\text{柱體積 Column Volume (mL)}} \\[1em] &= \frac{\text{56 (mm)}\times\text{30 (mL/min)}}{\text{15 (mL)}} \\[1em] &= \text{112 (mm/min)}\end{aligned}

當放大的目標管柱為 100 g 時，為保持相同的線速度，那麼可再次查表得到管柱長度為 15.8 cm（158 mm）、柱體積為 150 mL，套用換算公式即可得到建議的流速為 106 mL/min，此流速即可於 100 g 的管柱上保持相同的線速度。

\scriptsize\begin{aligned}\displaystyle\text{流速 Flow Rate} &= \frac{\text{線速度 Linear Velocity (mm/min)}\times\text{柱體積 Column Volume (mL)}}{\text{管柱長度 Bed Depth (mm)}} \\[1em] &= \frac{\text{112 (mm/min)}\times\text{150 (mL)}}{\text{158 (mm)}} \\[1em] &\approx \text{106 (mL/min)}\end{aligned}

結論與建議

1. 流速快慢影響管柱純化效率，主要是因為線速度的改變，進而影響縱向擴散與質量傳遞的結果。
2. 不同粒徑的填料都有相對應的最佳線速度，而大粒徑填料不僅數值較低，也對偏離最佳值較為敏感。
3. 對於容易分離的樣品，仍可採取高流速的純化策略，在不會影響純化分離的效果的同時，還能節省寶貴的時間；但面對不好純化的樣品而言，就應盡量將流速控制在最佳條件。
4. 為取得符合預期的結果，在放大純化規模時必須保持線速度一致，而不是僅僅依照放大的比例來調整流速。
5. 建議在實務中，先以小規模試驗找出最佳的流速，再經過換算，套用至不同尺寸的管柱與純化規模，可減少樣品、實驗材料與時間的消耗。

正確的操作不只是依靠經驗，更需要搭配理論與實驗數據支持。透過對流速、線速度與 HETP 的掌握，將可以更靈活地在純化品質與操作效率之間找到平衡，達到最佳的快速純化效果。