質體純化 – 策略與成本

質體( Plasmids )是一種不可或缺的工具，用於克隆( clone )、轉移( transfer )和操作基因。這些小型、環狀的DNA片段通常存在於細菌中，但也存在於一些古細菌( archaea )和真核生物( eukaryotes )中。它們只攜帶少量的基因，因此使得它們很容易被基因修飾。

正是由於質體易於操控、具有快速重製和長期穩定性的特性，使其成為許多現代研究的起點。例如，最近在DNA疫苗、mRNA疫苗和單株抗體( monoclonal antibodies )方面的進展，都是依賴質體的存在才得以實現的。

儘管質體普遍存在自然界中，但實驗室裡所使用的質體，大多都是人工合成的。對於在分子生物學( Molecular )和細胞生物學( Cell biology )等領域工作的科學家來說，質體純化是一項基本技術。但這項技術可能既消耗成本又勞力密集，尤其是要將質體用於短暫轉染( transient transfections )時。於大規模生產蛋白質和病毒載體( viral vectors )時，質體必須具有非常高的品質和純度，以確保能成功轉染。儘管質體純化的實驗方案相對成熟，但許多步驟不僅耗時，而且還增加了發生錯誤的機會。在這裡，我們將討論用於研究和藥物開發時，不同的質體純化方法，並突顯每種方法的優缺點，另外也會評估與每種方法相關的成本。

質體純化過程

製備質體涉及三個基本步驟：

(1)培養細菌菌株

(2)菌體收集與裂解( Lysis )

(3)質體DNA的純化。

儘管純化步驟非常重要，但在過去的40年中，質體純化方案並沒有發生太大改變，仍然是非常耗時且勞力密集。

在質體純化過程中，細菌細胞首先被離心下來，並裂解釋放出細胞內的DNA和其他細胞成分。隨後，可以先使用沉澱( Precipitation )和離心方法去除細胞成分，然後進一步從保留的上清液中純化出質體DNA。這個過程包括層析( Chromatography )的步驟，這是一種將混合物中的成分分離的過程。在純化轉染用質體的步驟中，通常會使用陰離子層析( Anion chromatography )來降低內毒素( Endotoxin )的含量。另外要從管柱沖提出質體時，所使用的緩衝液通常也含有大量鹽分，會導致產物被稀釋。因此，通常在最後還會使用酒精沉澱( Alcohol precipitation )，以降低鹽分濃度並增加質體的濃度，以便實現有效的轉染。

在質體純化過程中，首先對細菌細胞進行離心 (centrifuged)和裂解 (Lysed)，裂解會使DNA和其他細胞成分從細胞中被釋放出來；隨後，可以使用沉澱( precipitation )和離心去除細胞成分；接著，剩餘的上清液( supernatant )可進一步處理，即純化質體DNA。這個過程包括層析步驟，使混合物中的成分分離。在進行轉染的質體純化中，通常使用陰離子層析的配置來降低內毒素程度，而沖提緩衝液通常含有大量鹽分，導致產物會被稀釋，因此，通常最後會使用酒精進行沉澱的步驟，降低鹽分濃度，並增加質體的濃度，以便達成有效的轉染。

此外，轉染所需的質體純化，也可以透過以下三種方式完成：使用手動套件( kit )、外包給商業化的受託研究機構（Contract Research Organization, CRO），或使用自動化系統。讓我們更詳細地看看每種方式。

使用商業化套件進行手動質體純化

在研究和藥物開發中的質體純化方面，手動套件被視為是標準。因此，您可以根據需求，從Mini到Giga製備規模的商業套件中選擇。這些套件提供了一個行雲流水的方案，且具有許多優勢，包括高純度、高產量以及去除內毒素的步驟，使得到的質體適合用於轉染。這種方法的主要缺點是依賴高度手動且實驗步驟繁瑣。例如，當進行Maxi規模製備時，預計同時執行5到10個樣品需要約150分鐘，這意味著每個樣品需要15到30分鐘；但對於Giga規模製備來說，執行5個樣品的時間會增加到310分鐘，即每個樣品要62分鐘。根據所使用套件的規模的不同，單一個樣品的價格一般約在38美元到164美元之間。然而，還需要考慮人力成本，這意味著每個樣品的平均成本可能在51美元到216美元之間（參閱表1）。請注意，人力成本在不同國家和地區之間可能有所不同，因此可能會影響這些計算的結果。表1中，假設人力成本（全職僱員）為50美元/小時。

假設：

手動執行Maxi和Mega規模製備時，同時執行的最大樣品數為10個；Giga規模製備，最大樣品數則為5個。

人力成本為每小時50美元（根據全職僱員年薪95,000美元，每年262個工作日，每天7.5小時）。

在計算中使用了各供應商的標價。

廠商Q的處理時間：Maxi 150分鐘，Mega 220分鐘，Giga 310分鐘。

PhyPrep的手動工作時間：8分鐘，包括同時執行4個樣品的初始準備時間。

外包 – 質體純化

另一種可行的選擇是將質體純化步驟外包給受託研究機構( CRO )，CROs提供從Mini到Giga規模製備的一系列服務。外包質體製備有一些優點和缺點，其中一個優點是，可節省與手動方法相關的內部工作時間和相對應的成本，而實驗室人員節省的大量時間，則可專注於其他活動上；不過，外包可能會有相當長的交期，或許需要等待數周才能收到純化的質體。在過去幾年中，由於對質體的高度需求，外包質體也已經成為一個瓶頸。此外，外包的成本也比手動方法還要高，根據製備規模，每個樣品的價格可能為150美元到400美元之間或者更高（參閱表1）。

自動化 – 質體純化

在過去幾年中，自動化質體純化系統已經成為有效質體純化的替代方案，例如: Biotage^®的PhyPrep 全自動質體純化系統可用於Maxi、Mega和Giga規模的純化，該系統僅需花費少量時間進行樣品的初始準備，這意味著與上述手動純化方案相比，每個樣品與人力相關的成本將大大地降低，這也使研究人員能夠將他們的時間花在更具挑戰性的任務上。

接著，我們將比較由自動化與手動方法所純化而得的質體其純度和產率。自動化系統使用的沖提緩衝液，其鹽分濃度遠低於手動套件；這使得我們有機會在不影響樣品的轉染效率的前提下，略過最後的酒精沉澱步驟，進而減少質體純化的時間。而自動化也意味著產物的再現性( reproducibility )和一致性( consistency )將更高，且製備的成本變得具有競爭力，每個樣品的成本為53美元到168美元，實際價格將視製備規模而變動。

總結

質體是一種重要的生物工具，也是許多先進療法的起始材料。質體純化是獲得純質體的重要步驟，但這40年來許多製備方案並沒有改變。儘管手動套件具有成本效益，但也需花費大量時間，不僅導致人員需在實驗桌上度過很長的一段時間，還衍生昂貴的人力成本。而外包質體純化是另一個選項，可以減少人員在實驗室的工作時間，並釋出時間可做其他事情，然而，交期會較久且成本也明顯比較高。因此，Biotage^®開發了一個PhyPrep 全自動質體純化系統，不僅減少花費在實驗桌上的時間，而且還具有成本效益 — 在不影響品質的情況下，樣品處理的成本與手動套件相比，費用相差不多甚至更低，這使得研究人員能夠將時間花在更具挑戰性的任務上。