如何選擇C18逆相層析的孔徑大小

逆相層析( Reversed-phase chromatography )是任何藥物研發流程中不可或缺的步驟，尤其是MS/MALDI分析前的去鹽( desalting )步驟。設計純化方案時，首先要先決定填料( resin )的種類，根據樣品的類型及後續的應用，有多種選項可供選擇。在不同填料類型中，需要考慮的一重要變數即為孔徑( pore size )。

孔徑，是指構成填料的矽膠顆粒( silica particles )之間的小孔隙。這些孔隙大大地增加了填料的表面積，甚至有99%的表面積皆位於孔隙中。因此，若要分析物能有效地與填料結合，其能否能進入這些孔隙就會是必要的條件。而樣品擴散到孔隙中是結合反應( binding reaction )的速率限制步驟( rate limiting step )，會由樣品大小和孔徑之間的關係決定。

樣品越大且越接近孔徑，擴散進入顆粒的速度就越慢，導致對填料的親和力( affinity )減弱。極端情況下，大於孔徑的目標將完全被排除在結合反應之外。

小孔徑( ~ 100 Å )會排除蛋白質及大型胜肽，但與較小或中型的胜肽則能良好結合。因此，在胜肽圖譜分析( peptide mapping )前，選用小孔徑填料來純化水解( digested )胜肽將更為理想。未經水解的蛋白質則不會與小孔徑的填料結合，因此可提高最終樣品的純度。但若要純化蛋白質或較大的胜肽，則需要更大孔徑( ~ 300 Å )的填料。

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