翻譯自 How to create a reversed-phase step gradient? — 2023, Bob Bickler, Biotage
梯度沖提在液相層析(Liquid chromatography)，例如：高效能液相層析法( High performance liquid chromatography, HPLC )、快速層析( Flash chromatography )中相當常見，一般可分為線性( Linear gradient )及階段式( Step gradient )兩種典型的梯度形式。線性梯度因相對簡單而被廣泛使用，但通常無法滿足專一性( Specificity )需求，將特定化合物純化至預期的程度；而這就是階段式梯度可以發揮作用的地方，階段式梯度將改善目標化合物的分離狀況。但是如何建立階段式梯度呢？
對於正相快速層析而言，薄層層析( Thin-layer chromatography, TLC )經常用於建立純化所需的梯度。Biotage® Selekt和Biotage® Isolera這類快速層析系統內建的軟體，可將單片TLC片的數據轉換為線性梯度，並依據兩片TLC片的數據建立出階段式梯度。
然而，由於逆向( Reverse-phase )TLC片其表面具有疏水( Hydrophobic )的特性，若以高度水相的溶劑作為展開劑，則恐會有潤濕性( Wettability )不足之問題，故逆相TLC在實際上並不常用。因此，逆相方法的開發和最佳化( Optimization )則需要以HPLC或小型的快速層析來完成。
逆相線性梯度( Linear gradient )的最佳化條件，是經由評估各種溶劑組合和梯度斜率來完成（通常是從甲醇 Methanol, MeOH 或 乙腈 Acetonitrile, ACN中擇一與水搭配）。然而，開發階段式梯度( Step gradient )方法的最佳化條件則又是另一回事。
一般在建立階段式梯度時，線性梯度沖提的資訊是很有幫助的，特別是目標化合物沖提所需的體積和強溶劑的比例。據目前所知，雖然沒有計算階段式梯度參數的數學公式，但經驗上如果化合物沖提所需的體積大於5個柱體積( Column volumn, CV )時，則可直接將起始的比例( % )增加至特定線性梯度比例。
舉例來說，如下方層析圖譜所示，要從600 mg的反應混合物中純化出少量的物質，使用6 g的 Biotage® Sfär C18 D – Duo 100 Å 30 µm 管柱，將線性梯度設定為35-100％，並以10個CV的條件進行沖提，產物將在7.9 CV處被沖提出來（圖1）。
根據這些數據，我們決定從50%階段式梯度開始純化，但50%這個數值是如何得出的？當然經驗很重要。然而，查看數據，以整個梯度距離10 CV來說，產物在7.9 CV處被沖提出來，將其換算成比值 7.9 CV / 10 CV = 0.79。而梯度變化（結束比例% – 起始比例% = 100% – 35% = 65%）乘以該比值( 0.79 )，即可獲得起始梯度( 51.35% )，簡單起見，將該值無條件捨去為50%。再根據以往的經驗， 3或4個CV作為一個階段的長度似乎效果最好，因此決定第一段沖洗條件訂在50%，4個CV。
再來要確定第二段沖提的比例，同樣依照以往的經驗和線性梯度數據。將線性梯度時的整個梯度距離10 CV減去沖提體積7.9 CV，就可得到第二階段的沖提距離，而比值則為0.21 ( 10 CV – 7.9 CV = 2.1，2.1 / 10 = 0.21 )；如果將該比值乘以梯度變化( 65% )，其結果可以大致預測需要提高的比例為13.65%，並將其無條件進位成15%。所以現在的階段式梯度為：以50%沖洗4 CV，接著以65%再沖提4 CV。
理論上，此梯度的設定應在65%的階段內沖提出目標化合物，因此後面可以直接將梯度增加到100%以清潔管柱。
最終梯度條件則為：
| 第一階段 | 第二階段 | 第三階段 |
| 50%甲醇 | 65%甲醇 | 100%甲醇 |
| 4 CV | 4 CV | 2 CV |
再次以6 g的 Biotage® Sfär C18 D – Duo 100 Å 30 µm 管柱進行少量樣品的階段式梯度測試。結果表明，儘管階段式梯度可能會造成峰尖分裂(Split Peak)的情況，但仍能符合預期並提供良好純化的結果（圖2）。
根據該結果，我以相同條件（同梯度）直接套用於30g Biotage® Sfär C18 D – Duo 100 Å 30 µm管柱，來純化剩餘的大量反應混合物（圖3）。
而最後的結果顯示，階段式梯度( Step gradient )不僅可得到良好的分離效果，溶劑消耗量僅需12 CV，也比線性梯度( Linear gradient )所需的16 CV，減少25%溶劑消耗量。
因此，當我們需要建立逆向階段式梯度時，可參考目標化合物的滯留時間( Retention ) 或 沖提體積( CV )，再以梯度起始以及結束的比例%)，即可得到一個合理的實驗條件，並利用小型純化管柱對其進行驗證及最佳化。
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